抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs) 是一类袖珍阳离子两亲肽白虎 自慰，可由多样动物、虫豸和植物体产生[1]。大部分招架菌肽作用机制的研究标明，抗菌肽不错整合并浸透入微生物膜，领略抑菌作用[2]，不易产生耐药性，且抗菌谱广[3]。频年来，抗菌肽被世俗觉得是最有后劲的抗生素替代药物[4]。同期，研究觉得[5]抗菌肽概况与核糖体聚会，干涉细菌卵白质合成进程。两栖类动物的皮肤分泌物因其独有的化学性质和生物合成阶梯以及潜在的临床应用价值而备受热心[6]。东北林蛙看成典型的两栖动物，在我国东北及相近地区世俗散布，具有浩瀚的药用价值[7]。dybowskin-1ST是由林蛙皮中索取的具有59个氨基酸残基的抗菌肽，它概况扼制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的滋长，同期具有促进伤口愈合、抗病毒等作用[8-12]。

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抗菌肽的基本结构为多肽链，氨基酸序列决定其理化性质及二级结构等因素，从而决定抗菌肽抑菌活性。Wang等[13]的研究顶用精氨酸取代赖氨酸可增强抗菌肽的抑菌活性，拓宽其抗菌谱。但是，移除抗菌肽Bac7[14]N-端的两个精氨酸残基使其大部分抑菌活性丧失。莫得凭证地进行氨基酸替换、抗菌肽合成、抑菌性能考据，会形成时刻及资本损耗。应用生物信息学步调，对氨基酸序列进行联系抑菌性能的参数预计，关于进一步了解抗菌肽的活性及作用机理具有浩瀚道理。本文对东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的理化性质、二级结构、磷酸化位点、疏水性、剪切位点等特征进行分析，并构建林蛙抗菌肽的系统发育树，同期对东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的生物学活性进行实践考据，以期深远合伙抗菌肽dybowskin-1ST的抑菌机制，为进行下一步卵白质改造提供可行念念路。

1 材料与步调 1.1 dybowskin-1ST抗菌肽

从NCBI中下载东北林蛙抗菌肽dybowskin- 1ST序列，基因ID：GU249565.1，卵白ID：ADC54260.1。其氨基酸序列为MFTLKKSLLLLFFLGTISLSLCEEERNAEEERRDYPEERDVEVEKRIIPLPLGYFAKKT。实践用dybowskin-1ST抗菌肽(纯度95%)，由上海楚肽生物科技有限公司合成。

1.2 实践动物

北华大学实践动物中心提供30例SPF级KM小鼠，速行将其分为不雅察组、对照组，其中不雅察组有小鼠20只，平均体重(26.7±9.6) g。对照组小鼠10只，平均体重(27.3±9.4) g。两组小鼠均为雄性，性别、体重等组间数据各别不权贵。

1.3 菌种

大肠埃希菌ATCC 43889、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、白假丝酵母菌ATCC 90028、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104，由中国科学院微生物研究所提供。

1.4 试剂及器材

8 mm口径小鼠皮肤打孔器，薇婷脱毛膏，创可贴，LB培养基(购于青岛海博生物本领有限公司)，四环素纸片(购于比克曼生物科技有限公司)。

1.5 dybowskin-1ST生物信息学预计 1.5.1 构建dybowskin-1ST系统发育树

利用MEGA_X对东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST (GenBank登录号：GU249565.1) 与黑龙江林蛙抗菌肽Temporin-AM (GenBank登录号：JF922737.1、JF922736.1)、Amurin-3 (GenBank登录号：AM233687.1)，北好意思豹蛙抗菌肽Temporin-1P (GenBank登录号：AM493728.1)、湿地林蛙抗菌肽Temporin H (GenBank登录号：Y09394.1)、Temporin B (GenBank登录号：Y09393.1)、东北林蛙抗菌肽dybowskin-1CDYa (GenBank登录号：EU827807.1)、福建大头蛙抗菌肽Limnonectin-1Fb (FR733639.1)、Limnonectin-1Fa (GenBank登录号：FR733638.1)、花臭蛙抗菌肽Brevinin-1S (GenBank登录号：AJ971790.1)、池沼林蛙抗菌肽Brevinin-1 PLc (GenBank登录号：AM745088.1) 进行同源性比对，并绘图系统进化树。

1.5.2 dybowskin-1ST理化性质预计

利用成心收录抗菌肽的数据库APD中进行抗菌肽生物信息学分析的网站ExPASy (https://web.expasy.org/) 上的ProtParam软件进行卵白质结构预计，此情势可得到其计算理化参数及疏水性，理化参数包括：表面等电点、分析氨基酸及原子组成、半衰期、GRAVY指数(Grand average of hydropathicity)、脂溶性指数、不踏实指数等

1.5.3 dybowskin-1ST疏水性预计

利用抗菌肽生物信息学分析的网站ExPASy (https://web.expasy.org/) 中Protscale软件分析dybowskin-1ST的疏水性。

1.5.4 dybowskin-1ST剪切位点预计

利用抗菌肽生物信息学分析的网站ExPASy (https://web.expasy.org/) 中PeptideCutter软件预计各胰卵白酶过甚他酶类物资作用于dybowskin-1ST的潜在剪切位点。

1.5.5 dybowskin-1ST信号肽剪切位点及亚细胞定位预计

为了在多样系统中抒发抗菌肽，需要进行信号肽的预计。基因翻译需经过信号肽分拣、运输、定位。信号肽用来结合卵白质从胞浆插手内质网、线粒体、叶绿体及核内。信号肽结合的重生多肽可通过内质网膜插手腔内，最终到达胞外。信号肽连接从合成后的卵白质被信号肽酶水解而被除掉。本研究使用SignalP-5.0 () 进行信号肽检测。同期应用TargetP 1.1 Server (-1.1/index.php) 进行抗菌肽的亚细胞定位分析。

1.5.6 dybowskin-1ST的跨膜区预计

生物体内的卵白质中，20%–30%都属于膜卵白，因此膜卵白在细胞的功能中占据重地面位。但是，对膜卵白进行多系统抒发，存在一定的难度。跨膜区域连接由有极性的α-螺旋组成，在细胞中常实施信号传导或转运通说念的功能。招架菌肽的多肽链的跨膜区域进行预计，概况对其异源抒发提供指挥作用。本研究使用TMHMM Server v.2.0 () 对dybowskin-1ST的跨膜区进行预计。

1.5.7 dybowskin-1ST磷酸化位点预计

磷酸化是浩瀚的卵白质翻译后修饰之一白虎 自慰，本研究独揽NetPhos 3.1 Server ()预计dybowskin-1ST磷酸化位点。

1.5.8 dybowskin-1ST二级结构预计

二级结构一般是抗菌肽抑菌活性的抒发区域，二级结构组成在抗菌肽组成细菌膜孔的进程中起决定性作用。Lv等[15]的研究标明猪抗菌肽PMAP-36的α-螺旋区域结构为与细菌膜相互作用的多肽区。计算研究标明[16]，β-折叠中包含的半胱氨酸概况形成二硫键，踏实抗菌肽构象。本研究选择ExPASy的SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、Jpred4 ()和DNAstar Protean分辨分析抗菌肽dybowskin-1ST的二级结构，多重预计其潜在抑菌性能。

1.5.9 dybowskin-1ST三级结构预计

用在线建模软件SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 及穿线法在线结构预计软件I-TASSER (-TASSER/)预计抗菌肽dybowskin-1ST的三级结构。

1.6 dybowskin-1ST的伤口愈相助用 1.6.1 分组及开发皮肤伤口模子

实践组(dybowskin-1ST)，对照组(甘油80%)。小鼠背部涂抹脱毛膏停留5 min，刮去小鼠背部毛，蒸馏水清洗后用75%酒精棉球擦洗皮肤消毒。无菌要求下用小鼠皮肤打孔器在小鼠背部制造两个直径为8.0 mm圆形创面(去除全层皮肤)。

1.6.2 创面处理

伤口模子开发后，用打孔器在创可贴上打出相易大小的孔，用剪刀稍许扩大创可贴启齿面积使其粘贴于小鼠创口周围，局部固定小鼠伤口周围皮肤，使皮肤不易滑动，使得小鼠皮肤伤口的愈合只可靠细胞再生杀青。用无菌棉球算帐小鼠创口处血污，分辨用80%甘油、dybowskin-1ST (1 500 mg/L)、生理盐水以0.1 mL/只的剂量涂抹于相应组小鼠的创口处，实践组小鼠左侧伤口涂抹dybowskin-1ST，右侧伤口涂抹生理盐水；对照组小鼠左侧伤口涂抹80%甘油，右侧伤口涂抹生理盐水。当然暴露创口，每天定时用药1次，流畅用药15 d，不雅察记载创口愈合情况。

1.7 dybowskin-1ST体外抑菌实践 1.7.1 菌种活化

树立1 mL液体培养基：取10 μL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌、铜绿假单胞菌在37 ℃下摇床过夜培养12–15 h，使其浊度对应0.5麦氏比浊，应用生理盐水将上述菌液稀释100倍，使其含菌量在(1×105–1×106) cfu/mL足下，备用。

1.7.2 纸片法抑菌实践

将空缺纸片浸润于100 mg/L的dybowskin- 1ST中，取出后去除其过剩水分，得到浓度约为100 mg/L的dybowskin-1ST纸片。菌液混匀后，用棉签蘸取均匀涂布于LB固体培养基名义。以四环素纸片为阳性对照，将100 mg/L的dybowskin- 1ST纸片与四环素纸片甩掉于平板培养基得当位置，每组实践重迭2次。将平板置37 ℃培养箱中静置过夜培养8 h后，取出，不雅察扫尾。

1.7.3 dybowskin-1ST最低抑菌浓度(MIC) 测定

选择微量肉汤稀释法测定dybowskin-1ST及庆大霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration，MIC)。在96孔板的每个对应孔中加入100 μL稀释好的菌液(1×106 CFU/mL)，dybowskin-1ST (1.5 mg/mL–0.09375 mg/mL) 及庆大霉素(128 μg/mL–0.25 μg/mL) 药液倍比稀释后加入100 μL，甩掉在37 ℃恒温培养箱中培养18 h。次日取出96孔板，以小孔内十足扼制细菌滋长的最小药物浓度为该药的MIC值。分辨竖立菌液阳性对照及生理盐水阴性对照。

2 扫尾与分析 2.1 抗菌肽dybowskin-1ST基因序列同源性比对及系统进化树

通过MEGA_X进行同源性比对，扫尾如图 1所示，东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST与黑龙江林蛙抗菌肽Temporin-AM、Amurin-3、北好意思豹蛙抗菌肽Temporin-1P、湿地林蛙抗菌肽Temporin H、Temporin B、东北林蛙抗菌肽Dybowskin-1CDYa、福建大头蛙抗菌肽Limnonectin-1Fb、Limnonectin- 1Fa、花臭蛙抗菌肽Brevinin-1S、池沼林蛙抗菌肽Brevinin-1 PLc的参考序列，同源性均在80.00%足下，其中与东北林蛙抗菌肽dybowskin-1CDYa的同源性最高，为94.97%。其次是与湿地林蛙抗菌肽Temporin B的同源性较高，为81.99%。系统进化树分析扫尾如图 2所示，抗菌肽dybowskin-1ST与东北林蛙抗菌肽dybowskin-1CDYa位于脱色分支上，具有较近的亲缘关系。

2.2 理化性质预计扫尾

经ProtParam分析，抗菌肽dybowskin-1ST中含59个氨基酸残基，分子式为C318H510N80O93S2，总原子数为1 003。dybowskin-1ST氨基酸序列组因素析见图 3。dybowskin-1ST疏水性氨基酸占总氨基酸的38.98%。抗菌肽的杀菌活性与疏水性呈正计算，但疏水性氨基酸的占比并未定定通盘抗菌肽的疏水性，只可起到一定的参考作用。其他参数如分子量、等电点、带电氨基酸数量、半衰期、踏实性、疏水性和亲水性信息见表 1。当不踏实指数大于40时，讲解卵白不踏实。多肽中脂肪族氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的含量不错决定其脂溶性指数[17]。脂肪指数响应了卵白质和多肽的热踏实性，同期不错决定疏水面的深度，从而影响抗菌肽疏水性[13]。从检测扫尾不错看出dybowskin-1ST的热踏实性较好，半衰期较长。一般来说，亲水性平均总共(Grand average of hydropathicity，GRAVY) 取值在−2到+2之间，负值标明为亲水性卵白。该抗菌肽GRAVY为−0.358，标明该卵白亲水性较强。

2.3 疏水性预计扫尾

通过ProtScale器用在线分析发现(本实践使用Kyte和Doolittle等磋商出的氨基酸疏水参数预计抗菌肽的疏水性)，dybowskin-1ST的最大疏水指数为2.689，位于第13位氨基酸，最小疏水指数为−3.378，位于第35位氨基酸，见图 4。凭证图 4可知，dybowskin-1ST多肽链两头自满为亲水性，且总体亲水性要大于疏水性，预计为亲水性卵白，与理化性质分析扫尾一致。

2.4 剪切位点预计扫尾

通过PeptideCutter软件分析得出，dybowskin-1ST中的大多数氨基酸位点可分辨被18种活性物资剪切(表 2)，其中被剪切可能性最大的位点汇注在多肽链两头，分辨是第1、9、10、54、55位氨基酸。在上文疏水性分析中得知，dybowskin-1ST两头大多自满出亲水性，亲水性区域的踏实性较弱，因此此处氨基酸位点较易被剪切。另外，剪切位点较多的酶主要有卵白酶K、胃卵白酶(pH > 2)、嗜热菌卵白酶、胃卵白酶(pH 1.3)。

2.5 信号肽剪切位点及亚细胞定位预计扫尾

经SignalP-5.0分析，该抗菌肽可能存在信号肽区域。如图 5所示，X轴为dybowskin-1ST卵白序列的59个氨基酸残基；Y轴透露各参数的数值；C值透露剪切位点存在可能性，为图中红线所示；S值为信号肽存在可能性，为图中绿线所示；Y值是聚会S值和C值进行空洞分析给出的值，为图中蓝线所示。据预计扫尾自满，C值最大值在第27–28位氨基酸残基，在此区域最有可能出现剪切位点，其次为19位氨基酸。空洞Y值和S值，S值跳跃阈值0.5，而Y值未跳跃，标明抗菌肽dybowskin-1ST可能具有信号肽。dybowskin-1ST亚细胞定位分析自满，分泌通路信号肽的可能性为0.024, 线粒体靶向肽的可能性为0.944，其他卵白的可能性为0.054。

2.6 跨膜区预计扫尾

据TMHMM Server v.2.0分析扫尾自满(图 6)，品红色线透露各氨基酸处于膜外的概率，扫尾标明dybowskin-1ST多肽链不含跨膜区域，且该卵白属于膜外卵白。

2.7 dybowskin-1ST磷酸化位点预计扫尾

NetPhos 3.1 Server预计抗菌肽dybowskin- 1ST (图 7) 3位、16位苏氨酸残基处存在磷酸化修饰位点，7位、18位、20位丝氨酸残基处存在磷酸化修饰位点，35位、54位酪氨酸残基处存在磷酸化修饰位点。

2.8 dybowskin-1ST二级结构预计扫尾

选择SOPMA在线软件预计dybowskin-1ST的二级结构。如图 8A所示，dybowskin-1ST二级结构主要由α-螺旋(Alpha helix)、蔓延链(Extended strand)、β-转角(Beta turn)和无规卷曲(Random coil)组成，其中有26个氨基酸参与α-螺旋(蓝色)的形成，占44.07%；10个氨基酸参与蔓延链(红色) 的形成，占16.95%；2个氨基酸参与β-转角(绿色) 的形成，占3.39%；21个氨基酸参与无规卷曲(紫色) 的形成，占35.39%。二级结构预计标明该卵白主要以α-螺旋为主，可臆想该抗菌肽具有较强的抑菌活性。应用Jpred4进行二级结构分析的扫尾见图 8B，此情势预计扫尾有限，红色线条代表α-螺旋区域，分辨在Leu4-Ile17、Arg39-Glu44、Pro49-Ala56，而其他类型二级结构未能得出预计扫尾。为了进一步获取二级结构在多肽链中的具体区域，利用DNAstar Protean软件的Garnier-Robson法和Chou-Fasman法进一步分析卵白质二级结构，如图 8C所示，扫尾见表 3。两种步调都自满dybowskin-1ST二级结构中α-螺旋占相比高，与上述论断基本相符。

2.9 dybowskin-1ST三级结构预计扫尾

利用SWISS-MODEL在线同源建模对dybowskin-1ST三级结构的预计扫尾(图 9A)，由于阑珊同类型模板及同源结构，此情势无法给出dybowskin-1ST的结构域组成及互作情势，自满仅为dybowskin-1ST的Leu10到Arg32畛域内的三级结构暗示图。使用穿线法在线预计软件I-TASSER进行三级结构预计扫尾(图 9B)，两种扫尾都自满结构中α-螺旋数量较多。

2.10 dybowskin-1ST B细胞表位/T细胞表位预计扫尾

使用ABCpred处事器预计(阈值为0.85)dybowskin-1ST含有3个B细胞抗原表位(表 4)。利用SYFPEITHI在线软件，经HLA-A*02:01 (截至性CTL细胞表位) 分析(阈值为19) dybowskin-1ST共有6个T细胞抗原表位(表 5)。经MHC分型RT1.AI预计(阈值为19)，发现有2个T细胞抗原表位(表 5)。

2.11 dybowskin-1ST的伤口愈相助用

小鼠皮肤伤口模子见图 10。经不雅察，涂抹dybowskin-1ST的小鼠伤口名义肉芽组织成列较为整都，胶原散布均匀，大体无脓性分泌物，炎症反应较轻，标明抗菌肽一定进程地扼制了创面的细菌滋长，同期愈合边际较为整都；而甘油对照组创面有白色脓性分泌物，肉芽组织干燥皱缩，重生胶原较少且成列芜乱(图 11)。

2.12 dybowskin-1ST的体外抑菌作用

通过纸片法测定dybowskin-1ST (经紫外分光光度计法测定浓度为100 mg/L) 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌的抑菌作用，扫尾标明dybowskin-1ST对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌扫尾，但对白假丝酵母菌无显著抑菌扫尾，扫尾见图 12和表 6。

选择96孔板法测定dybowskin-1ST对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)，扫尾见表 7。

3 筹商

多重耐药菌逐步成为大众健康危急，包括院内感染耐药菌及抗生素糜掷导致的家禽衍生常见菌等，导致多产业生物健康问题，东说念主们要紧需要研发出区别于传统抗生素作用机制的新式抗菌剂[18-19]。抗菌肽属于机体固有免疫组分，在好多组织和细胞中抒发，以响应Toll样受体(TLR) 信号通路的激活[20]。有研究标明，抗菌肽可通过休养体内抗菌肽抒发加强东说念主体先天免疫[21]。抗菌肽被世俗招供的“成孔模子”抑菌机制，导致其不易产生耐药性。de Breij等[19]的研究标明，抗菌肽SAAP-148概况通过对细菌膜产生浸透作用扼制部分多重耐药菌株滋长和生物膜形成。但是，抗菌肽血清踏实性低，易被胰卵白酶等水解，存在细胞毒性、生物利费用低及坐褥资本高级问题，截至了其进一步深远的临床应用。因此，当今研究东说念主员以自然抗菌肽为基础，应用氨基酸替换、截断等有策划进行卵白质改造，克服自然抗菌肽的不及，擢升应用性。同期，Bhonsle等[22]觉得将非自然氨基酸应用于抗菌肽改造有策划中，概况擢升其代谢踏实性和药代能源学等计算参数。总之，应用于抗菌肽的卵白质改造已成为其发展为踏实抗菌剂的势必方针。

林蛙看成自然两栖类动物，皮肤等腺体可分泌宽阔多肽类物资。dybowskin-1ST是东北林蛙皮肤分泌物中筛选出的新式抗菌肽，概况促进小鼠伤口愈合，可有用扼制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性，但关于真菌及耐药菌的作用较弱。为改换亲本肽活性，遐想出具有更高抑菌活性和踏实性的抗菌肽，本研究对dybowskin-1ST进行生物信息学分析，扫尾自满其表面等电点为5.10，电荷量为−2，亲水性平均总共为−0.358，负电荷氨基酸总和为12，正电荷氨基酸总和为10。卵白内含有较多的亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸，疏水性氨基酸含量较少，可能会导致其整合到脂质双层膜中介导细菌膜的浸透和卤莽的才智较弱。dybowskin-1ST所带的负电荷和亲水肽的特质可能是截至其抑菌才智的主要原因。经预计，dybowskin-1ST可分辨被共18种物资剪切，这可能是因为卵白酶切割位点主要汇注于赖氨酸和精氨酸。SignalP-5.0及TMHMM Server v.2.0扫尾自满，dybowskin-1ST有信号肽，无跨膜区，请示dybowskin-1ST可能为分泌卵白，可通过构建载体进行抒发和索取。经抗原表位预计，dybowskin-1ST具有T细胞表位和B细胞表位，可应用抗菌肽的抗原性进行定量检测。在对dybowskin-1ST多肽链的二级结构及三级结构预计中，α-螺旋均占相比高，这与其抗菌活性的体现有在径直计算性。

dybowskin-1ST为59个氨基酸的抗菌肽，寻找到其抑菌活性抒发区域是缩短坐褥资本并有用保留活性的要害。对dybowskin-1ST进行N-端和C-端截短并通过生物信息学步调进一步预计，扫尾自满，将C-端截短至保留N-端17个氨基酸时，该多肽链的α-螺旋占比、踏实性、电荷数较为相宜高活性抗菌肽要求，因此笔者团队规划以保留dybowskin-1ST N-端17个氨基酸的多肽链(MFTLKKSLLLLFFLGTI) 为基础进行氨基酸修饰白虎 自慰，以求获取较高抑菌活性的新式抗菌肽。同期为擢升衍生肽疏水性，以疏水性氨基酸替换15位Gly、16位Thr (亲水氨基酸)，同期可形成齐全的α-螺旋肽链；使用Arg、Lys替换3位Thr、15位Gly、16位Thr，使衍生肽电荷数在+4至+6之间，幸免过高的电荷量导致细胞毒性加多[13]。抗菌肽的疏水性与其抑菌活性及细胞毒性均呈正计算，因此，需要在疏水性、细胞毒性和活性之间取得得当的均衡。为幸免使衍生肽疏水性过强，应在一定畛域内(疏水力矩0.08–0.12及疏水性0.8–1.2) 进行疏水性氨基酸替换。举座来讲，招架菌肽进行氨基酸改造应翔实结构及参数的均衡，幸免卤莽原有结构[16]。通过以上念念路进行母肽的氨基酸截短和修饰，聘请其中电荷数、疏水性及踏实性等性质较为适中且相宜研究要求的进行后续实践，包括抑菌实践、细胞毒性实践、生物膜扼制实践等。由于抗菌肽不是通过单一受体或免疫系统的线性信号通路领略作用的简便免疫休养剂，生物信息学步调概况通过构造卵白质空间结构预计抑菌活性，但筛选出潜在抑菌活性较强的衍生肽后，仍需加以进一步实践考据，以此但愿获取概况措置抗生素耐药性问题的新式抗菌肽。